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针对上述问题，汉堡大学Wolfgang J. Parak教授团队提出了一种创新性的细胞内塑料降解概念：将塑料降解酶设计为"细胞内细胞器"，使其定位于内吞体/溶酶体中，从而降解被细胞吞噬的纳米塑料颗粒。研究重点探讨了实现这一概念所需克服的三大技术难题——游离酶难以被细胞高效内吞、酶的最适pH与溶酶体酸性环境不匹配、以及酶与塑料颗粒可能处于不同的囊泡中，并提出了相应的解决策略。该文章于2025年12月16日以《Enzyme-Loaded Microcapsules as Intracellular Organelles for the Degradation of Nanoplastics by Cells》为题发表于《ACS Nano》(DOI: 10.1021/acsnano.5c15213)。

（1）PETase的重组表达与PET纳米颗粒的制备及表征

重组IsPETase（简称PETase）在大肠杆菌BL21中表达并顺利获得His标签纯化取得，PET纳米颗粒粒径约为138±19 nm（图1a）。为便于观察，同时制备了掺入罗丹明B的PET纳米颗粒（PET-RB NPs）。PET及PET-RB纳米颗粒的理化性质经表征确认，其在含盐和蛋白质溶液中的荧光及胶体稳定性良好。PETase顺利获得胶囊包裹形成PETase@caps（图1b）。

图1.(a) PET-RB纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像。比例尺为200 nm。(b) PETase@caps的光学显微镜图像。比例尺为5 μm。

（2）PETase的pH依赖性及胶囊包裹策略

PETase在中性或弱碱性条件下活性最佳，在酸性环境（pH=4）中水解效率极低（图2b）。为实现细胞内递送，采用聚电解质层自组装技术将PETase包裹于可生物降解的微胶囊中（PETase@caps），壳层结构为（DEXS/pARG）₄，直径约3.3 μm。超声破碎胶囊后验证，包裹后的PETase在pH=8仍保持酶活性（图2c）。为解决溶酶体酸性环境限制，将壳层中的两层pARG替换为支化聚乙烯亚胺（PEI），形成（DEXS/pARG）₂/（DEXS/PEI）₂结构（图1b），利用PEI的质子缓冲能力在局部维持较高pH。含PEI的PETase@caps在pH=4条件下仍表现出酶活性（图2d）。微胶囊可顺利获得脂筏介导的巨胞饮作用被细胞内吞进入溶酶体，而PET纳米颗粒因尺寸差异可能顺利获得不同内吞途径进入细胞，两者未必共定位于同一囊泡。

图2.基于HOTP荧光强度（λex=326 nm，λem=438 nm）检测PETase水解PET的荧光分析法。（a）pH=8磷酸盐缓冲液中PET及PET-RB纳米颗粒在有无PETase条件下的孵育；（b）不同pH值下PETase对PET纳米颗粒的降解；（c）超声破碎后（DEXS/pARG）4壳层PETase@caps在pH=8或4条件下的酶活性；（d）超声破碎后含PEI缓冲层（DEXS/pARG）2/（DEXS/PEI）2壳层PETase@caps在pH=8或4条件下的酶活性。

（3）PET-RB纳米颗粒与BSA-FITC@caps（模拟PETase@caps）在HeLa细胞内的共定位验证

HeLa细胞先与PET-RB纳米颗粒孵育，次日加入BSA-FITC@caps，再次过夜孵育后用LysoTracker标记溶酶体。共聚焦显微镜显示PET-RB与BSA-FITC存在部分共定位（图3），对照实验排除了荧光通道串扰。壳层中的PEI可瞬时打开溶酶体膜，使部分BSA-FITC释放至细胞质，表现为FITC荧光从胶囊向细胞质扩散。图像显示部分内吞的PET纳米颗粒与FITC-BSA共定位，但无法定量判断共定位发生于溶酶体内还是细胞质中。基于有限图像数据未进行Manders系数等定量统计分析。数据表明若替换为PETase@caps，壳层降解后部分PETase可与PET-RB纳米颗粒共定位，在PEI缓冲的溶酶体或细胞质中性pH环境下实现PET水解，两种途径可能同时存在。

图3.HeLa细胞经PET-RB纳米颗粒、BSA-FITC@caps（模拟PETase@caps）及LysoTracker染色后的共聚焦显微镜图像。FITC通道存在过曝以显示释放的BSA-FITC，RB荧光以伪彩色（蓝色替代黄色）显示以便肉眼观察共定位。比例尺为20 μm。

（4）HeLa细胞内PET-RB纳米颗粒的降解验证

HeLa细胞先与PET-RB纳米颗粒孵育1天，去除未内吞颗粒后，加入PETase@caps处理1天，微孔板读数仪检测显示细胞内RB荧光随时间下降（图4），而无胶囊对照组荧光保持恒定。单细胞实验进一步验证：细胞经PET-RB纳米颗粒和PETase@caps共孵育后，细胞内PET-RB荧光点（图5a白圈所示）荧光强度低于胞外颗粒，且随时间持续降低（图5b-d），而无酶对照组荧光恒定（图5c）。单颗粒追踪排除了光漂白、非降解外排或聚集状态变化等干扰因素。结果表明PETase@caps可介导细胞内PET-RB纳米颗粒的部分降解及片段外排，但2天后仍有残留荧光，未完全降解。

图4.细胞经PET-RB纳米颗粒预处理1天后，再经PETase@caps处理不同时间t所记录的RB荧光强度IRB，数据点为20个不同孔读数的平均值及标准差。

图5.（a）细胞经PET-RB纳米颗粒及可选PETase@caps共孵育24小时后的图像，溶酶体经LysoTracker深红染色，共孵育组中圆圈标记细胞内PET-RB纳米颗粒，比例尺100 μm；（b-d）细胞内PET-RB纳米颗粒荧光随时间衰减曲线，图5c中实线和虚线分别代表细胞内和细胞外PET-RB纳米颗粒，原始数据见图S22-S52，图5d对照组无PET-RB纳米颗粒，所示强度为背景值。